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Purification et clonage d'une rhamnogalacturonase tolérante à un substrat acétylé
Les rhamnogalacturonases (RGases) connues jusqu à présent sont gênées par la présence de substituants acétyles sur leur substrat, les rhamnogalacturonanes (RG). Une nouvelle RGase ayant la particularité de pouvoir dégrader des RG fortement acétylés a été détectée dans le mélange enzymatique commerci...
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| Format : | Thèse ou mémoire |
| Langue : | français |
| Titre complet : | Purification et clonage d'une rhamnogalacturonase tolérante à un substrat acétylé / Jessica Normand; sous la direction d'Estelle Bonnin; co-directeur Philippe Delavault |
| Publié : |
[S.l.] :
[s.n.]
, 2008 |
| Description matérielle : | 1 vol. (199 f.) |
| Note de thèse : | Thèse doctorat : Biochimie, biotechnologie enzymatique : Nantes : 2008 |
| Disponibilité : | Publication autorisée par le jury |
| Sujets : |
| Résumé : | Les rhamnogalacturonases (RGases) connues jusqu à présent sont gênées par la présence de substituants acétyles sur leur substrat, les rhamnogalacturonanes (RG). Une nouvelle RGase ayant la particularité de pouvoir dégrader des RG fortement acétylés a été détectée dans le mélange enzymatique commercial Driselase®, issu du basidiomycète Irpex lacteus. Afin de suivre la purification de cette enzyme, puis de la caractériser, des RG ayant un degré d acétylation de 45 ont été préparés par dégradation enzymatique et fractionnements chromatographiques de pectines de betterave. La RGase a ensuite été purifiée à partir de Driselase® en mettant en place et en optimisant différentes techniques de fractionnement permettant d éliminer les protéines contaminantes présentes dans le mélange. La RGase purifiée a une masse molaire de 55 kDa et ses optima de pH et température sont compris respectivement entre pH 4,5-5 et 40-50C̊. Les produits de dégradation de l enzyme ont été analysés par spectrométrie de masse afin de déterminer son mode d action. Il a alors été constaté que la RGase tolère la présence d acétyle sur l acide galacturonique réducteur des oligomères produits. Parallèlement un ADNc pleine longueur de 1460 pb codant pour une RGase a été isolé à partir de cultures d Irpex lacteus grâce à des stratégies RT et RACE PCR. Cet ADNc a été cloné chez le système d expression hétérologue Pichia pastoris afin de produire une RGase recombinante. Plusieurs clones présentant un haut niveau d expression ont été isolés. Des mesures d activité enzymatique pratiquées sur les milieux de culture de ces transformants ont montré qu une RGase recombinante a pu être produite avec succès Up to now, known rhamnogalacturonases (RGases) are hampered by the presence of acetyl substituants on their substrate, the rhamnogalacturonan (RG). A new RGase which is able to degrade highly acetylated RG, was detected in the commercial enzymatic mixture Driselase® derived from the basidiomycete Irpex lacteus. To monitor the purification of this enzyme and to further characterize it, acetylated RG with a degree of acetylation of 45 has been prepared using enzymatic degradation and chromatographic fractionations of sugar beet pectin. The RGase was then purified from the Driselase® mixture performing different techniques of fractionation allowing to remove contaminating proteins present in the mixture. The purified RGase has a molecular mass of 55 kDa and its optimal pH and temperature are between pH 4.5-5 and 40-50C̊, respectively. The degradation products of the enzyme have been analyzed by mass spectrometry to investigate its mode of action. It has been shown that the RGase is tolerant to the presence of an acetyle on the reducing galacturonic acid of the product oligomers. In parallel, a 1460-bp full-length cDNA encoding a RGase was isolated from Irpex lacteus cultures using RT and RACE PCR strategies. The cDNA was cloned in the heterologous expression system, Pichia pastoris in order to produce a recombinant RGase. Several clones exhibiting high expression level have been selected. Enzymatic activities measurements realized on culture media of these transformants showed that a recombinant RGase was successfully produced |
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| Bibliographie : | Bibliogr. f. 157-169 |