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Caractérisation du système CRISPR/Cas9 et amélioration de l'édition de génome pour la génération d'iPS humaines et de rats génétiquement modifiés
CRISPR/Cas9 a révolutionné l édition de génome en l élargissant à des espèces animales et des types cellulaires variés. Les nombreuses études sur CRISPR permettent une bonne compréhension générale du système (études cristallographiques, enzymatiques et mécanistiques ). Toutefois, il reste encore de...
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| Auteurs principaux : | , , , , , |
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| Collectivités auteurs : | , , |
| Format : | Thèse ou mémoire |
| Langue : | français |
| Titre complet : | Caractérisation du système CRISPR/Cas9 et amélioration de l'édition de génome pour la génération d'iPS humaines et de rats génétiquement modifiés / Vanessa Chenouard; sous la direction de Ignacio Anegon et de Yacine Cherifi |
| Publié : |
2021 |
| Accès en ligne : |
Accès Nantes Université
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| Note sur l'URL : | Accès au texte intégral |
| Note de thèse : | Thèse de doctorat : Biologie moléculaire et structurale, Biochimie : Nantes : 2021 |
| Sujets : |
| Résumé : | CRISPR/Cas9 a révolutionné l édition de génome en l élargissant à des espèces animales et des types cellulaires variés. Les nombreuses études sur CRISPR permettent une bonne compréhension générale du système (études cristallographiques, enzymatiques et mécanistiques ). Toutefois, il reste encore de nombreux aspects à étudier pour une meilleure maîtrise de l édition de génome et une meilleure efficacité de génération de modèles génétiquement modifiés, même pour les plus complexes. Ces derniers nécessitent l insertion d une large séquence ADN (cassette d expression, gène rapporteur, système conditionnel ) ou plusieurs séquences contenant une structure particulièrement complexe (double insertion de sites loxP flanquant un exon ) qui diminuent fortement l efficacité de recombinaison homologue requise pour leur génération. J ai donc caractérisé la base moléculaire du système CRISPR/Cas9. En particulier, j ai étudié la formation du complexe RNP par différentes techniques notamment la Nano Differential Scanning Fluorimetry et sa fonctionnalité clivage in vitro. Ces études m ont permises de démontrer que, dans des conditions optimales de formation de ce complexe (tampon, Cas9, guide ARN ), un ratio Cas9 protéine /dual guide ARN 1/1 est suffisant. J ai donc appliqué ce principe aux cellules iPS humaines et embryons de rats pour confirmer ces résultats et déterminer in vivo les concentrations optimales de Cas9 et court donneur ADN afin d obtenir les meilleurs taux d insertion d une courte séquence simples. Cette preuve de concept nous a permis d obtenir plus de 50% de succès dans les deux modèles utilisés. En parallèle, nous avons tenté deux approches d import d un donneur ADN via le guide ARN qui ne nous ont pas permis d améliorer la génération de nos modèles mais d autres stratégies de ce type sont en cours. L ensemble de ces résultats permettra un emploi de CRISPR/Cas9 plus maîtrisée et ouvre la voie à une réflexion sur l optimisation de l utilisation des longs donneurs ADN pour la génération de modèles complexes de façons plus efficaces et maîtrisé. CRISPR/Cas9 has revolutionized genome editing by spreading human modeling to a large variety of species and types of cells. The numerous studies of this system have accelerated its understanding, in particular crystallography, enzymatic and mechanistic studies. Nevertheless, a large number of aspects remained to be studied for better control of genome editing and for improved genetically modified model s generation efficacy, especially for complex models. To generate those ones, insertion of large DNA sequence (expression cassette, reporter, conditional system ) or multiple sequences with complex structure (double insertion of loxP sites flanking exons ) is required. Those particularities reduce homologous recombination used for their generation. Thus, I have characterized the molecular basis of CRISPR/Cas9 system. In particular, I have studied RNP complex formation by different technics, in particular Nano Differential Scanning Fluorimetry , and its functionality by in vitro cleavage. I have demonstrated that using optimal RNP complex formation conditions (buffer, Cas9, guide RNA...) Cas9 protein/dual guide RNA ratio 1/1 is enough. We have next applied those settings to human iPS cells and rat embryos to confirm them in vivo. We also determine optimal Cas9 and short DNA donnor concentrations to improve insertion efficiency. This proof of concept allowed us to reach more than 50% of succes for both models. In parrallel, we tested two unsuccessful strategies to import the DNA donor to the nucleus via the guide RNA. Other strategies are ongoing. All these results gives new insight into CRISPR/Cas9 usage to better master this tool. Moreover, it opened new reflexion for optimal large DNA donor usage for complex models generation with high efficacy and better control. |
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| Variantes de titre : | CRISPR/Cas9 system characterization and genome editing improvement for genetically modified human iPS cells and rat embryos generation |
| Notes : | Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Rennes) Partenaire(s) de recherche : Centre de Recherche en Transplantation et Immunologie (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : François Moreau-Gaudry (Président du jury) ; Francina Langa (Membre(s) du jury) ; François Moreau-Gaudry, Lydia Teboul (Rapporteur(s)) |
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