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Characterization of rAAV vectors packaging in baculovirusinfected insect cells
Les vecteurs dérivés du virus adéno-associé (AAVr) constituent des outils de choix pour le transfert de gène in vivo. Leur innocuité a notamment contribué à leur attractivité et leur utilisation dans des essais cliniques de thérapie génique. Afin d'étendre le champ de leur application au traite...
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| Auteurs principaux : | , , , , |
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| Collectivités auteurs : | , , , |
| Format : | Thèse ou mémoire |
| Langue : | anglais |
| Titre complet : | Characterization of rAAV vectors packaging in baculovirusinfected insect cells / Magalie Penaud; sous la direction de Philippe Moullier et de Eduard Ayuso |
| Publié : |
2018 |
| Accès en ligne : |
Accès Nantes Université
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| Note sur l'URL : | Accès au texte intégral |
| Note de thèse : | Thèse de doctorat : Biomolécules pharmacologie thérapeutique : Nantes : 2018 |
| Conditions d'accès : | Thèse confidentielle jusqu'au 06 février 2020. |
| Sujets : |
| Résumé : | Les vecteurs dérivés du virus adéno-associé (AAVr) constituent des outils de choix pour le transfert de gène in vivo. Leur innocuité a notamment contribué à leur attractivité et leur utilisation dans des essais cliniques de thérapie génique. Afin d'étendre le champ de leur application au traitement de maladies systémiques, un défi majeur reste à relever : leur production à grande échelle. Le système d'infection de cellules d'insecte par des baculovirus peut répondre à ce challenge, pourtant la biologie de l'AAV dans ces cellules reste méconnue. Ceci se répercute par la présence de particules vides ou par une perte d'infectiosité des vecteurs viraux produits. Le travail présenté dans ce manuscrit a pour objectifs de 1) déterminer l'efficacité et la spécificité d'encapsidation du gène d'intérêt dans les capsides d'AAVr 2) étudier le lien entre ces paramètres et l'expression des protéines Rep et 3) définir le rôle de la protéine AAP (assembly-activating protein) en cellules d'insecte. De façon inédite, nous avons montré que moins de 30% des particules générées contenaient le transgène et que l'ADN baculoviral représentait jusqu'à 2,1% du contenu des capsides d'AAV, avec une prédominance pour les séquences proches des ITR (inverted terminal repeats). Enfin, nous avons démontré que l'AAP était essentielle pour l'assemblage des particules d'AAV2 dans les cellules Sf9. Ce projet participe non seulement à l'élucidation des mécanismes· d'encapsidation des AAV dans les cellules d'insecte mais répond également aux exigences des organismes réglementaires en proposant une technique d' avant-garde d'évaluation des contaminants ADN présents dans les stocks de vecteurs AAV. Due to their efficiency and safety, recombinant adenoassociated virus (rAAV) vectors have been widely used for gene therapy. ln the past few years, there have been a large number of positive clinical outputs using AAVbased products spanning broad therapeutic areas. However, the generation of rAAV at sufficient quantity and quality appears as a bottleneck on the path to commercialization. The baculovirus-infected insect cell platform has proven to tackle this challenge, yet, surprisingly, the biology of rAAV in insect cells remains largely unknown. As a result, current vectors suffer from quality problems such as generation of empty particles or reduced infectivity. The objectives of the present work are 1) to determine the rAAV packaging efficiency and specificity in insect cells 2) to investigate the link between packaging and Rep proteins expression, and 3) to decipher the role of the assembly-activating protein (AAP). First, we showed that less than 30% of rAAV particles contained the gene of interest in S19 cells cleared lysate. Second, we found that baculoviral DNA contamination is below 2.1% of encapsidated DNA, with a higher representativity for sequences close to the inverted terminal repeats. Finally, we demonstrated that functional AAP is strictly required for rAAV2 particles assembly in insect cells. Altogether, our data provide novel insights into the biological mechanism of rAAV genome packaging in insect cells and suggest that there is still room for improvement in order to increase vector quality. From a safety perspective, this project has allowed the development of an accurate quality control method to assess DNA contamination in viral vector stocks. |
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| Variantes de titre : | Caractérisation de l'encapsidation du génome recombinant dans les particules d'AAV lors de leur production en cellules d'insecte |
| Notes : | Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Rennes) Partenaire(s) de recherche : Université Bretagne Loire (COMUE), Thérapie Génique Translationnelle des Maladies Génétiques (Nantes) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Guangping Gao (Président du jury) ; Hildegard Büning (Rapporteur(s)) |
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