NantilusÉvolution dirigée de l'alpha-L-fucosidase de Thermotoga maritima en alpha-L-transfucosidase et application à la synthèse regiosélective d'oligosaccharides
Les glycanes, en particulier, les oligosaccharides fucosylés (FucOS), sont de plus en plus reconnus pour leurs rôles biologiques clés. Ces oligosaccharides sont impliqués dans les processus biomoléculaires tels que les communication intercellulaires, la régulation de la croissance, les processus inf...
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| Auteur principal : | |
|---|---|
| Collectivités auteurs : | , , |
| Autres auteurs : | , |
| Format : | Thèse ou mémoire |
| Langue : | anglais |
| Titre complet : | Évolution dirigée de l'alpha-L-fucosidase de Thermotoga maritima en alpha-L-transfucosidase et application à la synthèse regiosélective d'oligosaccharides / George Oyamo Osanjo; sous la direction de Charles Tellier et Michel Dion |
| Publié : |
[S.l.] :
[s.n.]
, 2007 |
| Description matérielle : | 1 vol. (163 f.) |
| Note de thèse : | Thèse de doctorat : Biochimie : Nantes : 2008 |
| Disponibilité : | Publication autorisée par le jury |
| Sujets : |
| LEADER | 07910cam a2200409 4500 | ||
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| 200 | 1 | |a Évolution dirigée de l'alpha-L-fucosidase de Thermotoga maritima en alpha-L-transfucosidase et application à la synthèse regiosélective d'oligosaccharides |b Texte imprimé |f George Oyamo Osanjo |g sous la direction de Charles Tellier et Michel Dion | |
| 210 | |a [S.l.] |c [s.n.] |d 2007 | ||
| 215 | |a 1 vol. (163 f.) |c ill. |d 30 cm | ||
| 310 | |a Publication autorisée par le jury | ||
| 320 | |a Bibliogr. f. 150-163 . Index | ||
| 328 | |b Thèse de doctorat |c Biochimie |e Nantes |d 2008 | ||
| 330 | |a Les glycanes, en particulier, les oligosaccharides fucosylés (FucOS), sont de plus en plus reconnus pour leurs rôles biologiques clés. Ces oligosaccharides sont impliqués dans les processus biomoléculaires tels que les communication intercellulaires, la régulation de la croissance, les processus inflammatoires, la différentiation cellulaire, la fertilisation, et les métastases de cancers. Chez l homme, les déterminants du groupe sanguin d ABO ainsi que ceux de Lewis sont des glycotopes fucosylés. Ces composés et leurs analogues suscitent désormais un grand intérêt scientifique vu leur potentiel thérapeutique et leur capacité à contribuer aux diagnostics. La synthèse chimique des FucOS est un procédé délicat nécessitant de multiples étapes de protection et déprotection qui aboutissent souvent à des rendements médiocres. Dans l objectif de développer des méthodologies pour accéder plus efficacement aux FucOS, nous nous sommes intéressés à l -L-fucosidase (Tm- -fuc) de Thermotoga maritima, laquelle a été soumise à un processus d évolution dirigée afin de la transformer en transfucosidase, qui catalyse le transfert du groupement fucosyle d un donneur sur un accepteur oligosaccharidique. Antérieurement à ce travail, aucune tentative pour améliorer l activité transglycosidasique de -L-fucosidases sauvages par des méthodes d ingénierie protéique n avait abouti. Au cours de ce projet, l évolution dirigée, technique qui a émergé ces dernières années comme méthodologie puissante pour explorer les relations structure/fonction des protéines, a été utilisée pour l ingénierie du répertoire catalytique de la Tm a-fuc et lui conférer de nouvelles propriétés. La Tm- -fuc native catalyse le transfert de l unité fucosyle du pNP-fucoside sur lui-même (auto-condensation) en formant une liaison -(1->3) ou sur un pNP-galactoside (transglycosylation) en formant des liaisons -(1->2), mais avec rendement très faible (7 %). Le gène codant pour l enzyme a été soumis à une mutagenèse aléatoire suivie de recombinaisons in vitro, et la sélection des mutants ayant une activité transférase améliorée a été réalisée au moyen d un crible utilisant un substrat chromogène. La caractérisation cinétique des l activité transglycosidasique et hydrolytique des mutants a été effectuée par résonance magnétique nucléaire (RMN) et par électrophorèse capillaire. L enzyme la plus évoluée présente une augmentation d un facteur 30 du rapport d activité transférase/hydrolyse, tout en gardant 60 % de l activité totale de l enzyme sauvage. Cet accroissement du rendement en synthèse est lié à l apparition de seulement trois mutations (T264A, Y267F, L322P) qui ne sont pas en contact direct avec le substrat dans le site actif. La modélisation moléculaire suggère que l une des mutations, T264A, provoque une réorientation d acides aminés en contact direct avec les substrats conduisant ainsi à une meilleure énergie de liaison. Ces mutants évolués constituent de nouveaux outils potentiels pour la synthèse de glycosides | ||
| 330 | |a Glycans, in particular fucosylated oligosaccharides (FOS), are now widely recognized as serving key biological functions. These oligosaccharides are implicated in biomolecular processes such as intercellular communication, growth regulation, inflammatory reactions, cellular differentiation, fertilization and tumour metastases. The human ABO and Lewis blood groups are determined by fucosylated glycotopes. There is now widespread scientific interest in these compounds whose analogues may become novel types of therapeutic or diagnostic agents. Chemical synthesis of FOS is a delicate process that requires many steps of protection and de-protection often resulting in unsatisfactory yields. In an effort to provide efficient methodologies for synthesis of FOS, -L-fucosidase (Tm fuc) from Thermotoga maritima, has been subjected to directed evolution to develop it from a glycosyl hydrolase into a transfucosidase that catalyse transfer of fucosyl groups from an activated donor onto a suitable acceptor compound. Prior to this work, no successful attempts on the enhancement of transglycosylation activities of natural a-L-fucosidases by protein engineering methods have been achieved. This project has used directed evolution, a technique that has emerged within the recent past as a powerful alternative methodology for exploring the structure/function relationship in proteins, to engineer the biocatalytic machinery of Tm a-fuc and confer on it new properties. The native Tm -fuc catalyses oligosaccharide synthesis by transfer of a fucosyl residue from a pNP-fucoside donor to pNP-fucoside (self-condensation) with -(1->3) regioselectivity, or to pNP-galactoside (transglycosylation) with -(1->2) regioselectivity at low yields (7 %). The native enzyme was submitted to a cycle of random mutagenesis and in vitro recombinations. Enzyme variants with improved transferase activity were identified by first selecting those with weak hydrolysis on a chromogenic substrate, followed by assessment of transglycosylation yield by thin layer chromatography. Further transferase and hydrolytic kinetics of the mutants were investigated by nuclear magnetic resonance and capillary electrophoresis. The most evolved mutant exhibited a 32-fold increase in the transferase/hydrolytic kinetic ratio, while keeping 60 % of the overall wild type enzyme activity. Such synthetic improvement was obtained with only three mutations (T264A, Y267F, L322P), which are all located in the second amino-acid shell of the enzyme active site. Molecular modelling suggests that some of these mutations (T264A, Y267F) cause a reorientation of the amino acids that are in direct contact with the substrates resulting in a better docking energy. Such mutants with high transglycosidase activity constitute novel enzymatic tools for synthesis of fucosylated oligosaccharides | ||
| 541 | | | |a Directed evolution of the alpha-L-fucosidase from Thermotoga maritima into an alpha-L-transfucosidase and applications in regioselective synthesis of oligosaccharides |z eng | |
| 606 | |3 PPN034524274 |a Fucosyltransférases |3 PPN027253139 |x Thèses et écrits académiques |2 rameau | ||
| 606 | |3 PPN031461867 |a Glycosidases |3 PPN027253139 |x Thèses et écrits académiques |2 rameau | ||
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| 686 | |a 570 |2 TEF | ||
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