NantilusApport de l'amplification génique en temps réel dans le contrôle de l'absence de contamination par le virus de l'hépatite A des dérivés sanguins et des aliments
Le virus de l'Hépatite A (VHA) est un virus nu particulièrement résistant aux techniques d'inactivation virale. Sa présence dans des pools de plasmas à usage thérapeutique, ainsi que dans des prélèvements issus de l'industrie agro- alimentaire pose un réel problème de santé publique....
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| Format : | Thèse ou mémoire |
| Langue : | français |
| Titre complet : | Apport de l'amplification génique en temps réel dans le contrôle de l'absence de contamination par le virus de l'hépatite A des dérivés sanguins et des aliments / Marie-Hélène Aleman-Trevidic; sous la dir. de Sylviane Billaudel, Virginie Ferre |
| Publié : |
[S.l.] :
[s.n.]
, 2003 |
| Description matérielle : | 186-[33] f. |
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| Note de thèse : | Thèse doctorat : Pharmacie. Virologie moléculaire : Université de Nantes : 2003 |
| Disponibilité : | Publication autorisée par le jury |
| Sujets : |
| Résumé : | Le virus de l'Hépatite A (VHA) est un virus nu particulièrement résistant aux techniques d'inactivation virale. Sa présence dans des pools de plasmas à usage thérapeutique, ainsi que dans des prélèvements issus de l'industrie agro- alimentaire pose un réel problème de santé publique. Le moyen le plus efficace d'assurer la qualité des produits commercialisés est la mise à disposition d'outils technologiques très performants, permettant l'éviction des échantillons contaminés. Deux techniques de détection du VHA ont été mises au point. La première est une technique sensible de détection par RT-PCR en temps réel, qui met en œuvre la technologie Taqman, pour amplifier la région 5' non codante du génome du VHA. La sensibilité de cette technique est de 300 génomes équivalents par ml à 95% et de 50 génomes équivalents à 50%. Après sa validation aux normes européennes, elle est appliquée en routine, depuis plus de 30 mois, ce qui correspond à l'analyse de plus de six millions des dons. La recherche systématique du VHA dans les pools plasmatiques thérapeutiques a permis de garantir l'assurance qualité des produits dérivés du sang. L'autre technique de détection du VHA est basée sur l'immunocapture (IC) de virions. L'approche réalisée par cette technique est l'extraction puis l'amplification des génomes de particules virales entières considérées comme infectieuses (IC-RT-PCR). Des billes magnétiques marquées par un anticorps anti-IgG de souris (billes-IgG) sont mises en contact avec le complexe VHA-Ac monoclonal. L'ensemble est porté à 95ʻC et l'ARN des virions est amplifié par la technique de RT-PCR en temps réel précédemment décrite. L'IC-RT-PCR a une sensibilité de 600 virus par réaction. Une fixation non spécifique d'ARN libre du VHA ou d'autres virus a été constatée. Elle ne représente que 0,2% des génomes présents. Enfin, l'IC-RT-PCR a été utilisée comme une technique de titrage de virions et comparée à la technique de détection des virus par plages de lyse, dans le cadre d'une étude de l'inactivation thermique du VHA, souche HM175 18F cytopathogène, en milieu PBS et dans des milieux modèles proches de la composition de jus de fruits. La décroissance virale constatée par la technique des plages de lyse est plus importante que celle mesurée par la technique génomique montrant que la température a une action sur la désorganisation de la capside virale et non sur l'acide nucléique. Les résultats obtenus mettent en évidence un effet protecteur des milieux modèles évalués, sur l'intégrité du VHA, qui n'existe pas en milieu PBS. La quantification de virus non ou difficilement cultivables comme le VHA, dans des milieux complexes qui subissent des procédés d'inactivation reste encore à évaluer. The Hepatitis A virus (HAV) is a naked virus known to be highly resistant to viral inactivation procedures. Its presence in plasma products used for therapeutic purposes, as well as in samples from the agricultural and food industries represents a major public health issue. The most effective means of ensuring good quality of commercialized products is that highly performant technological tools, allowing for the detection of contaminated samples, be made available. Two HAV detection methods have been developed in our laboratory. The first is a sensitive real time RT-PCR-based assay that uses the Taqman® technology to amplify the 5' noncoding region of HAV RNA. The sensitivity of this assay is of 95% with 300 genome equivalents/ml, and 50% with 50 genome equivalents/ml. This method was recently certified compilant with European standards and has been used routinely for over 30 months, which means that over 6 million blood donations have been analyzed using this method to date. Systematic screening of therapeutic plasma products for HAV ensures quality assurance of blood derived products. The second HAV detection method is based on the immunocapture (IC) of virions. This technique consists in extracting and amplify ing the genomes of viral particles that are considered infectious (IC-RT-PCR). Magnetic beads, labeled with a mouse anti-IgG antibody (IgG beads), are incubated with HAV-mAb complexes. The reaction is heated at 95ʻC and virion RNA is amplified using the above-mentioned real-time RT-PCR approach. IC-RT-PCR has a sensitivity of 600 copies per reaction. Non-specific binding of cell-free RNA from HAV or other viruses has been observed, but only represents 0.2% of all genomes present in the starting material. Finally, in a study of heat inactivation of a cytopathogenic strain of HAV, known as HM175 18F, in PBS medium and other media with a composition close to that of fruit juice, IC-RT-PCR was used as a virion titration method and was compared to the plaque assay. The observed viral decrease with the plaque assay is more important than that assessed using the genomic method, thus showing that temperature acts on viral capsid disassembly and not on nucleic acids. The obtained results demonstrate the protective effect of the selected media on HAV integrity, which is not observed with PBS medium. Viral decrease using inactivation procedures on strains that are difficult to culture or that cannot be cultured is yet to be analyzed. |
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| Variantes de titre : | Contribution of real-time genome quantification to the detection of HAV contamination of blood products and foods |
| Notes : | Accès au texte intégral de la thèse (au format PDF) |
| Bibliographie : | Bibliogr. f. 176-186 |